客户单位：中国科学院生物物理所范祖森课题组
中康博提供：Affymetrix mRNA+LncRNA 二合一芯片检测（筛选差异 mRNA 和 lncRNA）高通量生物信息分析（聚类分析、功能富集分析、KEGG 信号通路富集分析、网络分析）
推荐语：lncRNA 涉及到各种生物过程，包括转录调控，印迹，染色质修饰和核转运等。由临近编码基因相反方向转录的 lncRNA 占哺乳动物中 lncRNA 总数的 20％ 左右。研究报告称，这些调控临近编码基因的 lncRNA（反向性 lncRNA） 多对中胚层分化和心脏发育上发挥关键作用，然而，这类 lncRNA 的生物学作用在免疫系统上基本上是未知的。中国科学院生物物理所的范祖森研究员带领的研究小组于 2017 年 5 月 20 日在国际学术期刊《Nature immunology》上在线发表了一项名为 Long noncoding RNA lncKdm2b is required for ILC3 maintenance by initiation of Zfp292 expression 的最新研究论文，首次报告了他们在 ILC3s 中发现 lncKdm2b 的高表达，并且这一效应在 ILC3s 的维持和功能上起到了关键作用。
研究背景：近来已将 ILC 定义为自然免疫系统的一部分。ILCs 存在于粘膜表面，可促进免疫应答、维持粘膜完整性，促进淋巴组织发生。根据效应细胞因子，ILC 可以分为三种：ILC1s、ILC2s 和 ILC3s。其中有研究表明 ILC3 可能受转录因子控制，但如何调控或维护 ILC3 发生的机制仍然不清楚。LncRNA 是长于 200nt 的缺乏蛋白质编码潜能的核苷酸，比编码基因更具组织特异性和细胞型特异性，这表明它们在生理和病理上具有明显的生物学作用。然而 lncRNA 在免疫系统上的生物学作用基本上是未知的。在这里研究了 lncRNA——lncKdm2b 在 ILC3s 中高表达，是维持 ILC3s 所必需的。
研究结果：
1、LncKdm2b 缺失影响 ILC3 维持作用
研究识别出一个胚胎干细胞多能性维持所需的非特异性 lncRNA，并命名为 lncKdm2b（由 Kdm2b 基因剪切产生）。 LncKdm2b 缺失后胚胎在第 3 天（E3.0） 囊胚发育停滞，导致早期胚胎死亡。除了小鼠胚胎和大脑外，我们发现在小鼠肠内骨髓（BM），胸腺，脾脏和固有层淋巴细胞（LPL） 中， lncKdm2b 均高水平表达。 然后， 我们采用 RNA 荧光原位杂交（RNA-FISH） 检测淋巴祖细胞和淋巴细胞中 lncKdm2b 的表达水平， 发现 ILC3（Lin-CD45+RORγt+） 中 lncKdm2b 高表达。同时采用 CD127 和 CD45 抗体染色和探针技术进一步验证了 lncKdm2b 的特异性。这些数据表明 lncKdm2b 涉及调控 ILC3 维护。
2、lncKdm2b 缺失抑制 ILC3 增殖
ILC3 数量减少可能是由细胞死亡增加或细胞扩增减少引起的。为了评估体内 ILC3s 的周转率，我们给予小鼠 BrdU 处理 3d，然后采用流式细胞术测定小肠组织的摄取量。结果发现：与对照小鼠相比，lncKdm2b-/- 小鼠 ILC3s 的数量少得多。接下来，分离出野生型和 lncKdm2b 缺失型 ILC3s，用 CFSE 标记，并进行体内增殖测定。结果发现： 与野生型 ILC3 相比， lncKdm2b 缺失型 ILC3s 的增殖显著降低。同样地，lncKdm2b 缺失型 ILC3 中 Ki67+细胞的数量远低于野生型 ILC3。lncKdm2b 过表达后恢复了 ILC3s 的增殖水平。 但是，lncKdm2b 缺陷性小鼠中活性半胱天冬酶-3+ ILC3 的百分比与野生型小鼠相当，这表明 lncKdm2 缺失性 ILC3s 未发生细胞凋亡。总之， lncKdm2b 调节 ILC3s 的增殖，但不能调节细胞凋亡。
接下来，进一步确定 lncKdm2b 缺失引起的 ILC3 增殖变化是内在原因还是外在原因。我们将 5×106 CD45.2+ lncKdm2b-/-或 lncKdm2b+/+小鼠 BM 细胞移植进入致死辐射的 CD45.1+受体中。移植 8 周后，与 lncKdm2b+/+ BM 细胞受体相比，lncKdm2b-/-BM 细胞受体的 ILC3s 数量减少。接着进行了竞争性 BM 移植实验，分别将 CD45.1+野生型 和 CD45.2+ lncKdm2b+/+ 或 lncKdm2b-/- BM 细胞（1：1 混合）移植到致死性辐射受体小鼠 8 周，结果发现：与 lncKdm2b+/+ BM 细胞的受体小鼠相比，lncKdm2b -/- BM 细胞的受体小鼠的 ILC3s 数量减少。此外，与来自 lncKdm2b+/+BM 细胞相比，来自 lncKdm2b-/- BM 细胞的 ILC3s 增殖减少。因此，用 lncKdm2b-/-BM 细胞重建的受体小鼠也容易遭受 C. 啮齿动物感染。总而言之，这些数据显示 lncKdm2b 是一个 ILC3 维护的内在因素。
3、LncKdm2b与Satb1相关联
反向性的lncRNA通常正向调节临近编码基因。由于lncKdm2b与 Kdm2b序列上反向转录，因此我们检测了lncKdm2b-/- ILC3s中Kdm2b和其它临近基因的表达水平，结果发现它们的表达水平都没受到影响。这些数据表明lncKdm2b可能以反式发挥调控作用，而不是顺式。
研究通过RNA pull down和蛋白质谱鉴定出组织蛋白Satb1可以与 LncKdm2b相结合，并通过RNA pull down和RAP进一步验证。 Satb1呈现高表达水平，而相关蛋白Satb2没检测到。研究通过结构域比对，发现一个特定片段（nt450-700），是lncKdm2b和Satb1蛋白的特异性结合位点。 接着，通过RNA-EMSA进一步验证了该lncKdm2b片段与Satb1蛋白的结合位点。这些结果表明ILC3s中lncKdm2b直接与Satb1蛋白结合。
4、LncKdm2b 激活 Zfp292 的表达
为了进一步确定 lncKdm2b 调节的靶基因，我们进行 lncKdm2b +/+ ILC3s 和 lncKdm2b -/- ILC3s 的转录组芯片检测。在差异表达基因中，那些编码转录因子的基因在 lncKdm2b -/- ILC3s 中下调水平最为显著。 在下调最显著的前十名转录因子中，我们定位在一个没有特征的转录因子—Zfp292，它的表达水平下调了五倍，并通过实时荧光定量 PCR 和免疫印迹进一步验证了 Zfp292 在 ILC3 中的表达水平。值得注意的是，Zfp292 优先在 ILC3s 中表达。为了进一步研究 lncKdm2b 是如何调节 Zfp292 的表达，我们通过 CHIRP 实验，发现 lncKdm2b 在 Zfp292 启动子的特定区域（nt -1,200 至-600）富集。同时采用 ChIP 和 DNase I accessibility 实验发现：在 lncKdm2b-/- ILC3s 中，这个 zfp292 启动子区域（nt -1,200 到-600）的富集较少用于 H3K4me3（组蛋白活性标记），但更多用于 H3K27me3（组蛋白抑制性标记）。因此，lncKdm2b 缺失导致 Zfp292 启动子上 RNA 聚合酶 II 的富集减少，这进一步强化了抗 DNase I 消化力。这些数据表明 lncKdm2b 在 ILC3s 中激活 Zfp292 表达。
鉴于 lncKdm2b 可以结合 Satb1 蛋白和 Zfp292 启动子区域，接下来试图研究 Satb1 蛋白是否参与了 ZFp292 的表达调控。 ChIP 实验结果表明 Satb1 是能够结合 nt -1,200 至-600 的 Zfp292 启动子，EMSA 也证实了这一发现。这些数据表明在 ILC3s 中 Satb1 可能参与 lncKdm2b 介导的 Zfp292 表达调控。研究采用 CRISPR-Cas9 技术在小鼠中敲除了 Satb1，结果发现 Satb1 敲除后显着抑制 ILC3s 中的 Zfp292 表达。 lncKdm2b -/- ILC3s 中 SATB1 过表达能够挽救 Zfp292 的表达。因此，Satb1 与 lncKdm2b 协同调节 ILC3s 中 Zfp292 的表达。
5、LncKdm2b 募集 Satb1 和 NURF 到 Zfp292 启动子
据报道， Satb1 通过募集活性或抑制性染色质重塑复合物到基因启动子来调控基因表达。因此，我们假设 Satb1 可以募集某些分子调节 Zfp292 的表达。研究制备了野生型和 lncKdm2b 缺失型 LPL 裂解物，并采用抗 Satb1 用于色谱分析。通过 SDS-PAGE，然后进行银染和质谱分析。结果发现：lncKdm2b+/+ 和 lncKdm2b-/-两者相比，最为差异的谱带为 Bptf 和 Snf2l，它们是 NURF 染色质重塑复合物的一部分。在 lncKdm2b+/+ LPL 裂解液中 Satb1 抗体与 NURF 复合物免疫共沉淀， 但在 lncKdm2b-/-裂解物中不存在。
lncKdm2b 可以增强 Satb1 和 Bptf 之间的相互作用，而如果没有 lncKdm2b，Satb1 结合不能结合 Bptf。此外，lncKdm2b 能够从 Myc-Bptf 过表达细胞裂解物中沉淀出 Bptf，并通过 RIP 实验证实了这一结果。结构域比对发现，lncKdm2b 的 450-1,000（nt）区域结合 Bptf，并通过 EMSA 进一步验证。这些数据表明: 在 lncKdm2b+/+ILC3s 中 lncKdm2b 是 Satb1 与 NURF 复合物相互作用的必要条件。那 Bptf 是如何参与 Zfp292 的表达调控，研究用抗 Bptf 进行 ChIP 实验，发现在 ILC3s 中 Bptf 在 Zfp292 启动子区域富集。但是， lncKdm2b 敲除或 Satb1 敲除都会消除这种现象。通过交联处理发现，Satb1 与 NURF 复合物在 lncKdm2b+/+裂解物中，但不在 lncKdm2b-/-裂解物中。同时，Zfp292 启动子区域也可以在这些洗脱液中检测到。EMSA 实验结果表明 lncKdm2b 与 Satb1，Bptf 和 Zfp292 启动子可以形成复合物区域，而用 RNase A 和 RNase H 处理可以破坏这个复合体的形成。因此，Bptf 敲除可以抑制 Zfp292 表达，与 Satb1 敲除后细胞裂解物中得到的现象一致。这些数据表明 lncKdm2b 招募 Satb1 和 NURF 复合物到 Zfp292 启动子激活其表达。
6、Zfp292 缺失损害 ILC3 的维持及功能
为了进一步研究 Zfp292 在 ILC3s 调节中的生理作用，通过 CRISPR-Cas9 建立了 Zfp292 缺陷小鼠方法，结果发现：与野生型小鼠相比，Zfp292-/- ILC3s 的数量显着降低。同样地，IL-22+ ILC3 的数量也显着降低。此外，Zfp292-/- ILC3s 的增殖能力减弱。然而，Zfp292 过表达后恢复了 ZFp292 缺失引起的 ILC3 增殖受损，这表明需要 Zfp292 来调节 ILC3。值得注意的是，敲除 Satb1 和 Bptf 后能够抑制 ILC3 的增殖。在 Satb1-缺陷型和 Bptf 缺陷型小鼠中 ILC3 的数量的确下调。同时，比同窝出生对照小鼠相比，Bptf 缺陷型小鼠更易遭受 C. 啮齿动物感染。由于 Satb1 缺陷小鼠在出生后大约 4 周就死亡，因此，难以评估他们对 C. 啮齿动物感染的易感性。 与野生型小鼠相比，在 lncKdm2b-/- Satb1-/- Bptf-/- ILC3s 中 Zfp292 过表达可以挽救 ILC3 的增殖能力。
我们将 lncKdm2b-/-Satb1-/-Bptf-/-Zfp292 过表达的 ILC3 移植进入致死辐射的 CD45.1+受体小鼠，发现在移植后 8 周 Zfp292 过表达恢复了 ILC3s 的数量。此外， lncKdm2b 在 Zfp292-/-LPL 中的过表达并没有挽救 ILC3 增殖，而 lncKdm2b 过表达在 Zfp292 +/+ LPLs 中促进 ILC3 增殖。因此，Zfp292 -/-小鼠更易受影响 C. 啮齿动物感染。最后，与其同窝出生相比，lncKdm2b -/- Zfp292-/-小鼠的 ILC3 数量大量减少。与野生型对照小鼠相比，lncKdm2b -/- Zfp292-/-小鼠更受细菌感染。总而言之，Zfp292 在调控 lncKdm2b 介导的 ILC3 维持中发挥重要作用。
研究结论：在这项研究中我们发现长链非编码 RNA（lncRNA）-——lncKdm2b 高水平表达，它招募染色质组织器 Satb1 和核重塑因子（NURF）复合物到 Zfp292 启动子，激活转录因子 Zfp292，从而维持 ILC3s 及其功能。
PS：文章中涉及的基因芯片检测和数据分析由本公司完成！
参考文献：Long noncoding RNA lncKdm2b is required for ILC3 maintenance by initiation of Zfp292 expression. Nature Immunology.2017.
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